蛋白免疫印迹法(Western Blot, WB)是首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离,然后转移至固相载体(NC或PVDF膜等)上,固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,转移后的固相载体膜即称为blot,用于对蛋白质的进一步检测,印迹中的目的蛋白与一抗特异性结合形成抗原抗体复合物,进一步使用抗一抗的抗体——酶标二抗处理,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即可定位目的蛋白的位置。再用适当的底物溶液处理,使酶催化底物生成有颜色的产物,进行蛋白检测分析。
Western Blot的内容主要包括以下几个步骤:
样品制备与蛋白定量 → 上样与SDS-PAGE凝胶电泳 →蛋白的转印 → 封闭与抗体孵育 → 显色检测
一、WB样品制备
1.样品处理
针对样品,主要分为组织和细胞两类,在制备样品供分析使用时,一般采取物理和化学的方法进行破碎裂解。对于不同样品处理,可根据 (A) 进行选择使用。
(A)不同样品处理方式
实验样品 |
处理方式 |
悬浮细胞 |
离心收集细胞,PBS清洗去除残留胎牛血清。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。 |
贴壁细胞 |
刮刀将细胞刮下收集,PBS清洗去除残留胎牛血清。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。 |
组织 |
研磨匀浆组织。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。 |
2.裂解缓冲液的选择
对细胞或组织样品进行裂解是为释放其目的蛋白,不同裂解缓冲液对蛋白溶解能力各不相同。组织样品可选择裂解强度较强的裂解液,而细胞样品更适合裂解强度较温和的裂解液。其中,含有SDS和其他离子型去污剂的裂解缓冲液溶解能力最强,但是去污剂(SDS、Triton X-100)的存在会使蛋白变性,或者破坏蛋白质之间的相互作用。
结合自身实验需求,主要考虑其裂解缓冲液强度与成分,进行选择使用。
裂解缓冲液产品推荐
货号 |
产品名称 |
产品规格 |
用途 |
abs47014877 |
RIPA Lysis Buffer (Strong) |
100 ml |
裂解样品 |
abs47014881 |
NP-40 Lysis Buffer |
100 ml |
裂解样品 |
abs47014880 |
Lysis Buffer for WB/IP Assays |
100 ml |
裂解样品(非变性) |
abs47014932 |
Red Blood Cell Lysis Buffer |
100/250/500 ml |
裂解组织或血液样品并去除红细胞 |
3.抑制剂的选择
一旦裂解发生,蛋白的水解、去磷酸化和变性随即开始,为减缓这一系列的反应,需将样品置于冰上,并适当加入抑制剂。加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸 化蛋白的研究中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的。
(B)几种常见抑制剂
抑制剂 |
靶点 |
终浓度 |
抑肽酶 |
胰蛋白酶、糜蛋白酶、血纤维蛋白溶酶 |
2 μg/mL |
亮抑酶肽 |
溶酶体 |
1-10 μg/mL |
胃蛋白酶抑制剂A |
Asp蛋白酶 |
1 μg/mL |
PMSF |
Asp蛋白酶 |
1 mM |
EDTA |
镁和锰金属蛋白酶 |
1-5 mM |
EGTA |
钙金属蛋白酶 |
1 mM |
氟化钠 |
丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 |
5-10 mM |
原钒酸盐 |
络氨酸磷酸酶 |
1 mM |
焦磷酸盐 |
丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 |
1-2 mM |
β-甘油磷酸盐 |
丝氨酸和苏氨酸磷酸酶 |
1-2 mM |
抑制剂产品推荐
产品货号 |
产品名称 |
产品规格 |
用途 |
5871S |
Protease Inhibitor Cocktail (100X) |
1 ml |
抑制蛋白降解 |
abs812852 |
Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) |
50/100/200 mg |
抑制蛋白降解 |
abs47027936; abs42027527 |
Sodium orthovanadate(原钒酸钠) |
100/500 mg |
抑制蛋白降解 |
abs42017684 |
EDTA |
1/10 g |
抑制蛋白降解 |
4.蛋白的定量
对于获取的蛋白样品进行浓度测定,目前对于蛋白定量的方法主要有三种Bradford、Lowry和BCA法,牛血清白蛋白是常用的蛋白标准。
我们针对三种不同的蛋白定量法,对它们各自特点进行了简要的说明(C)。
(C)蛋白定量三种主要方法及特点
蛋白定量方法 |
原理 |
特点 |
Lowry法 |
蛋白质于碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物,使酚试剂还原成蓝色化合物,利用颜色深浅与蛋白质浓度的线性关系对样品蛋白进行定量。 |
灵敏性高(5 μg/ml);易受硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸及各种硫醇的干扰;耐受去污剂影响;耗时长(40~60min)。 |
Bradford法 |
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色,颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。 |
灵敏性较高(1-5 μg/ml);易受强碱性缓冲液、去污剂的干扰;耐受绝大部分样品中化学物质的影响;耗时短(5~15 min)。 |
BCA法 |
蛋白质价铜离子还原成亚铜离子,后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色络合物。 |
灵敏性很高(0.5~20 μg/ml);易受螯合剂和略高浓度还原剂影响;耐受一般浓度去垢剂干扰,抗干扰能力较强;耗时较短(<40 min)。 |
蛋白定量产品推荐
产品货号 |
产品名称 |
产品规格 |
用途 |
K813;7780S |
BCA Protein Assay Kit |
1盒 |
蛋白定量 |